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摘要: 以甜叶菊种子为外植体,成功建立了快繁再生体系。基本培养基为MS ,在添加了62BA 1. 0mg/ L 和NAA 0. 5 mg/ L 的培养基上最适于丛生芽诱导,诱导率为98. 6 %;最佳壮苗培养基为MS + 62BA 0. 5 mg/ L + KT 0. 5 mg/ L + GA 0. 2 mg/ L + NAA 0. 1 mg/ L ;试管苗最佳生根培养基为MS + NAA0. 2 mg/ L ,生根率达到99. 5 %;生根的试管苗移栽到装有田园土的土盆中,其存活率达到82. 4 %。本试验为甜叶菊快速繁殖工作奠定了良好的实验基础。

甜叶菊( S tevi a rebau di ana) 为菊科多年生草本植物,其叶中含有甜菊糖苷,又名甜叶菊糖苷、甜叶菊糖等。甜菊糖苷易溶于水,甜度约为蔗糖的300 倍,其热能仅为蔗糖的1/ 300 ,甜味接近蔗糖,味道好,安全无毒,可取代糖精、甜蜜素和部分蔗糖,广泛应用于食品、饮料、餐桌佐料、酱菜加工,还有防治糖尿病、肥胖症、小儿龋齿和高血压等疾患的药用价值,被誉为最有发展前途的新糖原,是继蔗糖、甜菜糖的第3 种天然糖原 ,因而日益引起人们的关注和重视。

虽然以茎尖为外植体进行甜叶菊组织培养已有报道,但直接以种子为外植体进行丛生芽诱导的研究较少,试验以种子为外植体,建立高效快繁体系,为甜叶菊快速繁殖技术体系的建立提供参考依据。

1 　材料和方法

1. 1 　材料

甜叶菊种子,由山东济宁甜叶菊研究中心提供。

1. 2 　方法

1. 2. 1 　材料准备　选择饱满的种子,用流水冲洗30min ,75 %酒精消毒50 s ,再用0. 2 %升汞消毒15 min ,用无菌水冲洗5 次。

1. 2. 2 　丛生芽诱导　基本培养基为MS ,诱导培养基中62BA 的浓度为1. 0 mg/ L ,NAA 的浓度为0. 1 、0. 3 、0. 5 、0. 7 和0. 9 mg/ L ,每个处理10 瓶,每瓶10 粒种子。培养基在灭菌之前将p H 调至6. 5 ,再装入240mL 的塑料瓶中,每瓶33 mL ,121 ℃灭菌20 min 。将准备好的外植体接种于丛生芽诱导培养基上,培养条件为温度25 ±1 ℃、光照强度100 μmol/ (m² ·s) ,光照时间12 h/ d ,培养32 d ,观察起始丛生芽诱导时间,统计丛生芽诱导率,玻璃化苗率和愈伤诱导率,选择出最佳丛生芽诱导培养基。

1. 3 　壮苗

　　将1. 5 cm 高的丛生苗单独分开,然后转接到壮苗培养基上,培养基中激素浓度分别为: KT (1. 0 、2. 0 、3. 0 和4. 0 mg/ L) ; 62BA (1. 0 、2. 0 和3. 0 mg/ L) +NAA 0. 1 mg/ L ;62BA (0. 5 和1. 0 mg/ L) + KT (0. 5和1. 0 mg/ L) + GA (0. 2 和0. 5 mg/ L) + 0. 1 mg/ L ,每个处理8 瓶,每瓶3 个芽。在温度25 ±1 ℃、光照强度100μmol/ (m² ·s) 和光照12 h/ d 的条件下培养,26 d后,观察叶尖的颜色,测量植株长度和苗的直径,求出平均值,选择出最壮苗培养基。

1. 4 　试管苗的生根和移栽

5. 0一6. 0 cm 高的试管苗转接到添加激素NAA的生根培养基上,NAA 设置的浓度梯度为0 、0. 1 、0. 2 、0. 3 和0. 4 mg/ L ,每个修理10 瓶,每瓶4 株试管苗。观察产生根的起始时间,24 d 后,测量根的直径和根的长度,统计生根率和每株的根数,选择出最佳根培养基。生根的试管苗移栽到装有园土的土盆中进行培养。

1. 5 　数据分析　　数据用STST App进行分析。

2 　结果与分析

2. 1 　2 ,42D 对诱导休眠芽愈伤产生的影响

62BA 和NAA 对丛生芽诱导具有明显的影响(表1略) 。结果显示,NAA 的浓度过高或过低,都降低丛生芽诱导率,当NAA 为0. 5 mg/ L 时丛生芽诱导率最高,达到98. 6 %(图1a略) ;随着NAA 浓度升高,愈伤诱导率增大,玻璃化苗率升高。13一14 d 后开始产生丛生芽,随着培养时间的延长,丛生芽的数量逐渐增加。根据丛生芽诱导率和苗玻璃化程度,丛生芽诱导最佳培养基为MS + 62BA 1. 0 mg/ L + NAA 0. 5 mg/ L 。

2. 2 　不同激素对芽生长的影响

不同激素对芽生长的影响(表2略) 。当培养基中的激素为62BA 和NAA 的组合时,随着培养时间的延长,株高减少,苗直径降低,除含62BA 0. 1 mg/ L 培养基外,其他培养基上的叶尖逐渐变黄;当培养基中的激素为62BA、KT、GA 和NAA 的组合时,随培养时间的延长,株高增加,直径增大,但只有62BA 0. 5 mg/ L +KT 0. 5 mg/ L + GA 0. 2 mg/ L + NAA 0. 1 mg/ L 的组合叶尖仍为绿色(图1b略) ;当培养基中只含有KT 时,植株均生长正常,其中KT 1. 0 mg/ L 效果最佳。根据株高、直径和叶尖颜色,芽最佳生长培养基为MS +62BA 0. 5 mg/ L + KT 0. 5 mg/ L + GA 0. 2 mg/ L +NAA 0. 1mg/ L 。

2. 3 　试管苗的生根和移栽

除无激素培养基外在所有生根培养基上试管苗的生根率均比较高(表3略) ,但根的质量差别很大。根据根的数量、长度和直径,最佳生根培养基为MS + NAA0. 2 mg/ L 。在最佳生根培养基MS + NAA 0. 2 mg/ L上,5 d 后开始形成根原基,24 d 后根长、根直径和每株根数分别可达到1. 6 cm、1. 1 mm 和6一7 条(图1c略) 。生根苗先移栽到营养钵,14 d 后再移栽到土盆,移栽存活率达到82. 4 %。

3 　结论

在丛生芽的诱导过程中产生大量的丛生芽,且这些丛生芽大部分玻璃化,但玻璃化芽通过壮苗都能恢复正常生长。由于产生的丛生芽数量很大,要及时分丛,且每丛不要带芽太多,否则由于拥挤和营养不良造成芽不能正常生长,甚至死亡。

在有的激素组合的培养基上,丛生芽诱导过程中产生明显的愈伤,这些愈伤继代后极易褐化,且芽分化难度较大。在本试验的基础上,利用愈伤组织途径建立高效的再生体系也是以后需要研究的课题。

利用组织培养快繁技术,不仅可以提高种苗繁殖速度和倍数,提高种苗质量,也是保持品种典型性的最佳方式。在本试验快速繁殖过程中,外源激素的种类及其浓度不同,对外植体的脱分化、再分化、增值和壮苗等都有较大的影响,这与前人在白头翁和红景天等所报道的结果一致。

在本研究中,以甜叶菊种子为外植体成功地建立了高效的快繁体系,丛生芽诱导率、生根率和移栽成活率都较高,但是丛生芽玻璃化较高,如何降低芽玻璃化是以后继续研究的课题。本试验为甜叶菊的快繁技术奠定了良好的实验基础。